什么是测序技术？（1/1）

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和转基因技术相比，另外一种分子生物学技术进展神速而且仍在蓬勃发展中，它对我们生活的影响比转基因可大太多了。但同样是因为争议小而默默无闻，那就是测序技术。

测序技术，作为现代生命科学研究中极为关键的一项技术，从诞生之初便不断推动着生物学领域的变革与发展。它的核心使命是测定DNA或RNA分子中碱基（A、T、C、G 或 A、U、C、G）的排列顺序，就如同解开生命遗传密码的钥匙，帮助我们深入洞察生命的奥秘。

第一代测序技术：奠基之作

第一代测序技术中最具代表性的当属桑格测序法（Sanger Sequencing） ，由英国生化学家桑格（Frederick Sanger）和考尔森（Alan R. Coulson）于1977年首次提出。其原理是利用双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）缺少3’ - OH，无法和脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，导致DNA聚合反应终止的特性。在4个同时进行的反应系统中加入待测序的DNA模板、DNA合成酶、dNTP、引物、缓冲液等，同时按一定比例加入四种少量带有放射性（P32）的ddNTP。引物与模板链结合后，DNA聚合酶将dNTP按碱基互补配对的原理添加到引物后面进行延伸，一旦ddNTP添加到正在合成的DNA链上，反应就会停止 。反应结束后，将这些以特定碱基结尾的片段分4个泳道进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过放射自显影片段末端的碱基，反向依次阅读DNA的碱基排列顺序。桑格测序法操作相对简单，测序读数长，结果准确性高，在20世纪90年代初到2010年左右被广泛应用，是基因组测序结果的金标准。不过，它也存在诸多局限，如低通量，一次只能测一个片段，样本起始量要求高，价格相对昂贵，需要大量人力投入，且灵敏度较低。

第二代测序技术：高通量的飞跃

为了实现大规模测序，满足日益增长的研究需求，第二代测序技术应运而生，也被称为新一代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）。其显着特征是高通量、低成本，能够从多个样本中提取大规模并行的高通量数据。这一代测序技术包括454测序技术、Solexa测序技术、SOLiD测序技术等。以Illumina测序技术为例，先将DNA进行片段化处理，通过物理（超声处理）或酶（内切酶）的方法把DNA打碎。在片段的3’端通过A - tailing反应添加一个腺嘌呤碱基形成突出端，使含有单个胸腺嘧啶突出碱基的接头能与DNA片段配对 。接头与固定在纳米孔表面的引物互补，引物起到固定DNA片段两端的作用，形成“桥”。接着通过聚合酶进行桥扩增产生双链桥，将双链分离后得到单链片段簇。加入带有荧光标记的dNTP，聚合酶将其添加到单链上使其延伸，荧光基团会阻止其他dNTP结合。每次dNTP结合到链上时，计算机记录下荧光基团的颜色，然后去除荧光基团继续合成，重复该过程直至获得DNA片段的序列。NGS技术一次运行能够对数以十万计甚至数十亿计的DNA片段进行测序，极大地提高了测序效率。目前，它已广泛应用于从头测序（de - novo sequencing）、重测序、SNP研究、转录组及表达谱分析、转录调控研究（ChIP - seq）等多个领域 ，在肿瘤相关、生殖遗传、感染相关的研究以及临床诊断中发挥着重要作用。

第三代测序技术：单分子测序的突破

2011年和2014年，PacBio和ONT公司分别发布了新型的单分子测序技术平台，标志着第三代测序技术的诞生。与前两代测序技术相比，其最大的创新点在于实现了单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，理论上可以测定无限长度的核酸序列，有效解决了二代测序读长短的技术难题，可以达到连续数十万base测序。不仅如此，它还适用范围广，不仅可以对DNA、RNA进行测序，还能观察蛋白质及遗传物质的表观遗传（甲基化）情况。然而，第三代测序技术目前也面临着一些挑战，例如准确性还有待进一步提高，成本相对昂贵，这在一定程度上限制了其在实际临床工作中的广泛应用 ，但在实验研究领域已取得了突破性的进展。

随着测序技术的飞速发展，如今已有数千种生物的基因组完成了全基因组测序 ，并且这个数字还在持续快速增长。中国也建立了自己的序列数据库——国家基因组科学数据中心，该中心依托中国科学院北京基因组研究所，联合中国科学院上海生命科学研究院和中国科学院生物物理研究所共同建设。它面向我国人口健康和社会可持续发展的重大战略需求，建立了生命与健康大数据汇交存储、安全管理、开放共享与整合挖掘研究体系 ，为国内外科研人员提供免费的数据存储服务，已经收集并存储了大量的组学数据 ，涵盖了基因组变异与表型关联、微生物分类与基因组资源、表观组关联分析、特色物种多维组学信息资源等多个方面的数据库 ，极大的推动了我国乃至全球生命科学研究的发展。

（写于2022年。）